ABSTRACT
Se estudió la regulación espacio-temporal de la actividad enzimática y de los niveles transcripcionales de la enzima fenilalanina amonio liasa (PAL por sus siglas en inglés) en clavel (Dianthus caryophyllus L.) inoculado con el patógeno causal del marchitamiento vascular. Se inocularon con Fusarium oxysporum f. sp. dianthi esquejes de dos variedades con diferencias en los niveles de tolerancia a la enfermedad -Kiss (tolerante) y Uconn (susceptible)- y se realizaron muestreos posinoculación a diferentes horas, tanto en el tallo como en la raíz, con el fin de evaluar los parámetros en estudio. Se determinó que durante la infección con el patógeno, la variedad tolerante presentó inducción de la actividad PAL en la raíz a las 48 horas de la inoculación. Esto indica que en este órgano de la planta se estimula la ruta fenilpropanoide, responsable de la generación de metabolitos fenólicos presentes en una alta diversidad de fenómenos asociados a resistencia vegetal. Considerando que durante la evaluación de los niveles de transcripción en este órgano de la planta mediante la técnica semicuantitativa de transcripción reversa y la posterior reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR por su nombre en inglés) no se presentó aumento importante en los niveles de mRNA para esta enzima, se evidencia la participación de mecanismos de regulación postranscripcional que determinan la generación de la enzima activa. En el tallo no se presentaron cambios en la actividad enzimática ni en los niveles transcripcionales, lo cual indica que la regulación de la respuesta de defensa de la planta está determinada por el órgano involucrado en el proceso de infección.
The spatio-temporal regulation of enzymatic activity and that of transcriptional levels of phenylalanine ammonia lyase enzyme in cuttings of carnation infected with the pathogen responsible of vascular wilting were studied. Carnation cuttings of two varieties which differ in disease tolerance-Kiss (tolerant) and Uconn (sus-ceptible)-were inoculated with Fusarium oxysporum f sp. dianthi and samplings were taken from root and stem at different times after inoculate them, to evaluate the parameters of interest. During infection, the tolerant variety showed an induction of PAL at 48 hours post-inoculation in roots, showing in this organ that the phenylpropanid pathway is stimulated. This pathway is responsible for producing phenolic metabolites that participate in phenomena associated with plant resistance. Having in account that during the evaluation of transcription levels in root, measured with semiquantitative technique RT-PCR, the levels of PAL mRNA were not increased, the participation of post-transcriptional regulation mechanisms for this active enzyme is evident. Taking in consideration that stem not presented differential induction in the enzymatic activity nor in levels of mRNA, we evidenced that regulation of responses of plant defense in this model is determined by the organ of the plant involved in the infection process.
com o fungo patogênico que causa o murchamente vascular. Inocularam-se estacas de cravo de duas variedades com diferentes niveles de tolerância à doença, Kiss (tolerante) e Uconn (susceptível) com uma Nesta investigação foi estudada a regulação espaço-temporal da atividade enzimática e dos níveis transcripcionais da enzima fenilalanina amônio liasa em estacas de cravo inoculadas cepa de Fusarium oxysporum f. sp. dianthi, e realizaram-se amostragens no caule e na raiz em diferentes horas pós-inoculação com a finalidade de avaliar os parâmetros em estudo. Foi determinado que durante a infecção com o fungo patogénico, a variedade tolerante Kiss apresenta uma indução da atividade PAL às 48 horas pós-inoculação na raiz, indicando que neste órgão da planta se estimula a via fenilpropanoide, responsável da geração de metabolitos de tipo fenólico que participam numa alta diversidade de fenómenos associados à resistência vegetal. Da mesma forma, considerando que durante a avaliação dos níveis de transcrição neste órgão da planta usando a técnica semi-quantitativa de RT-PCR não se apresentou aumento importante nos níveis de mRNA para esta enzima, se evidencia a participação de mecanismos de regulação postranscripcional que determinam a geração da enzima ativa. No caule não se apresentaram modificações na actividade enzimática, nem nos níveis de transcrição, indicando que a regulação da resposta de defesa da planta está determinada pelo órgão implicado no processo de infecção.
ABSTRACT
Se evaluó la inducción de peroxidasa en frutos de lulo con el fin de determinar su participación en las respuestas bioquímicas hacia el patógeno Colletotrichum acutatum, causante de la antracnosis. Se establecieron como mejores condiciones para su extracción y para determinación de la actividad: buffer fosfatos 100 mM pH 7, 1% SDS y 1 % PVPP; sustrato guayacol 15 mM, peróxido de hidrógeno 10 mM, pH 6,5, 55 °C y 30 µL de extracto. Se realizó un ensayo in vivo usando frutos verdes, pintones y maduros, inoculados con el hongo o con agua estéril. Se determinó la actividad peroxidasa a diferentes horas a partir de la inoculación, encontrándose una respuesta diferencial con el tiempo por efecto de la presencia del patógeno, y según el estado de madurez de los frutos. En lulos verdes inoculados con el hongo se observó aumento en la actividad al cabo de 6 y 144 horas. En lulos pintones no se observó efecto notable, mientras que en maduros el aumento en actividad fue prácticamente a todos los tiempos. Los resultados del contenido de fenoles totales mostraron que hubo acumulación a 96 y 144 horas por efecto del patógeno, para lulos en estado verde y maduro, mientras que para pintones, en los que se presentaron más rápido y con mayor severidad los síntomas de la antracnosis, no se observó aumento a ninguno de los tiempos. En los frutos más enfermos, el cambio en actividad peroxidasa y en contenido total de fenoles fue menos evidente, por lo que se sugiere una relación inversa de estos con el desarrollo de la antracnosis.
The induction of peroxidase in lulo fruits was evaluated in order to determine its participation in the biochemical responses towards the pathogen Colletotrichum acutatum, which causes the antrachnosis disease. For extraction and activity determination, these conditions were established as the best: buffer phosphates 100 mM pH 7, 1% SDS y 1 % PVPP; substrate guaiacol 15 mM, hydrogen peroxide 10 mM, pH 6,5, 55 °C and 30 µL of the extract. An in vivo test was developed using unripe, semi-ripe and ripe fruits, inoculated with the fungus or sterile water. The peroxidase activity was measured at different hours starting from the inoculation, finding a time differential response caused by the pathogen presence and according to the maturity state of fruits; in unripe lulo fruits inoculated with the fungus, an increase of the activity was observed after 6 and 144 hours. In semi-ripe fruits no considerable effect was seen, while in ripe fruits the increase of the activity was found practically at all times. The results of the measured total phenol content, showed accumulation at 96 and 144 hours as a result of the pathogen presence in unripe and ripe fruits, while for semi-ripe fruits, in which the antrachnosis symptoms were noticed faster and more severely, no phenol increase was found at any time. The less evident changes seen in peroxidase and phenol content, using severely affected fruits by the disease, suggest an inverse relationship between these parameters and the development of the antrachnosis.
A indução da peroxidasa foi avaliada na casca de frutos de lulo com a finalidade de determinar a sua possível participação em reacções de defesa contra o patógeno Colletotrichum acutatum, causador da doença antracnose. Foram estabelecidas as melhores condições para a sua extracção e para medir a actividade da enzima extraída, encontrando-se que com tampão fosfato 100 mM pH 7, 1% SDS y 1% PVPP, substrato guaicol 15 mM, peróxido de hidrogeno 10 mM, pH 6,5, 55 °C y 30 µL de extracto enzimático se conseguiram as actividades enzimáticas mais elevadas. Foi realizado um ensaio in vivo usando frutos verdes, em processo de maduração e maduros, inoculados com o fungo ou com água estéril. A actividade peroxidasa foi determinada a diferentes horas a partir da inoculação encontrando-se uma resposta diferencial com o tempo pelo efeito da presença ao patógeno e de acordo ao estado de madurez dos frutos. Em lulos verdes observou-se um aumento da actividade nos frutos inoculados com o fungo ao fim de 6 e 144 horas. Em lulos em processo de maduração, o patógeno não teve maior efeito, enquanto que em lulos maduros o aumento na actividade da enzima, como resposta à presença do patógeno, foi praticamente a todos os tempos avaliados. Os resultados do conteúdo de fenóis totais mostraram que ouve uma acumulação significativa a 96 e 144 horas por efeito da inoculação com o patógeno para lulos em estado verde e maduro, enquanto que para os lulos em processo de maduração, nos quais se apresentaram mais rápido e com maior severidade os sintomas de antracnose, não se observou aumento em nenhum dos tempo avaliados. Nos frutos mais afectados pelos sintomas, a mudança na actividade POD e no conteúdo total de fenóis foi menos evidente, motivo pelo qual se sugere uma relação inversa de estes com o desenvolvimento de antracnose.
ABSTRACT
Se evaluó la actividad polifenoloxidasa (PFO) en corteza de frutos de lulo con el fin de determinar su participación en respuestas hacia el patógeno Colletotrichum acutatum, causante de la antracnosis. Se estudiaron condiciones para la adecuada extracción de esta enzima, encontrándose que con buffer fosfatos 100 mM pH 7, 1% SDS y 1% PVPP se logran las mayores actividades. Se determinaron como mejores parámetros para medir la actividad de la enzima extraída, sustrato catecol 40 mM, pH 7,0, 23 °C y 30 µL de extracto. Para determinar su posible inducción en la interacción con el patógeno, se realizó un ensayo in vivo usando frutos verdes, pintones y maduros, inoculados con el hongo o con agua estéril. A nueve tiempos postinoculación se determinó la actividad PFO encontrándose que hay una respuesta diferencial con el tiempo y la madurez de los frutos y por efecto del patógeno. Se obtuvo aumento de actividad en lulos verdes a 48, 96 y 144 horas postinoculación (hpi) y en maduros a la mayoría de los tiempos evaluados, siendo éste estado en el que se presentó la respuesta más notable de inducción. En pintones aumentó solo a 72 y 144 hpi. Los mayores valores se registraron en general para frutos en estado verde. Los frutos respondieron al estrés ocasionado por la herida activando también esta enzima. La inducción de actividad se presentó a tiempos más rápidos en los frutos menos afectados por la enfermedad (verdes y maduros), por lo que se puede postular una relación positiva entre inducción de PFO y respuesta de tolerancia a la antracnosis.
Polyphenol oxidase (PFO) activity induction was evaluated in lulo fruits to determine the role of this enzyme in resistance responses towards the pathogen Colletotrichum acutatum which causes anthracnose disease. We studied the experimental conditions to obtain the enzyme, using lulo peel, and found that extraction with phosphates buffer 100 mM pH 7, 1% SDS y 1% PVPP showed higher activities. The adequate parameters for activity measurement was also evaluated and established as cathecol 40 mM, pH 7,0, 23 °C and 30 µL of extract. Then, we performed an in vivo assay using lulo fruits in three maturity stages, green, semimature and mature, which were inoculated with the fungus or with sterile water. Enzymatic induction of this protein was studied at nine postinoculation times, and it was found that the induction was differential according to the time, the maturity stage, and as consequence of pathogen presence. The PFO activity increased in green fruits at 48, 96 y 144 (hours postinoculation (hpi), and in mature lulos for the majority of times studied, with the most significant induction response at this stage. In semimature lulo, the induction was observed only at 72 and 144 hpi. The highest nominal value of activity was found in green fruits. Fruits responded to incision with enzyme activation. The increase in the activity of the enzyme was faster in the fruits with the minor anthracnose symptoms than the ones that were more affected. Therefore, it is possible to postulate a positive relation between PFO induction and tolerance to anthracnose symptoms.